清华大学陈国强教授团队和华南理工大学叶健文副教授合作AM：短中长链聚羟基脂肪酸酯PHA共聚物的合成平台构建

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自然界中部分微生物可合成聚羟基脂肪酸酯 (polyhydroxyalkanoate, PHA) 作为碳源及能量存储物。随着PHA良好和多样性的理化性质、生物相容性以及生物可降解性逐渐被科学家们发现，有望发展成为广泛应用的生物可降解高分子材料，在医疗植入、环保可降解包装、高端纺织品等领域找到更多应用。由于不同的结构可以带来不同的性能和应用，人们一直在寻找更新结构的PHA，渴望挖掘更好的前景。

新型PHA材料中，短链（short-chain-length, SCL）3-羟基丁酸（3-hydroxybutyrate, 简称3HB）与中链（medium-chain-length, MCL）3-羟基壬酸（九个碳C9）及其更长的3-羟基中或者长链（long-chain-length, LCL）脂肪酸（3-hydroxyalkanoates, 简称3HA, 链长C10-C18）共聚物一致是PHA微生物合成的挑战。人们一直梦想构建一个能合成这类共聚物（SCL-co-MCL/LCL PHA共聚物）的合成平台，来探索PHA的多元化结构的边界。100多年来，这梦想一致是梦想。

近日，清华大学陈国强团队和华南理工大学叶健文使用合成生物学的方法，通过在嗜虫假单胞菌Pseudomonas entomophila中搭建3HB和3HA（C9-C18）合成基因模块，并进行代谢通量调控, 成功获得了SCL-co-MCL/LCL PHA共聚物的定制化合成平台（图1）。

图1. 新型短中长链共SCL-co-MCL/LCL PHA共聚物合成平台

左边模块为3HB 合成代谢路径，右边为部分删除了beta-氧化途径的中长链3HA合成基因模块。低特异性的PHA合成酶PhaC_61-3把3HB与3HA(C9-C18)聚合得到多种共聚物。

研究团队选取了天然能利用脂肪酸的嗜虫假单胞菌作为底盘细胞，构建和表征了一系列组成型和诱导型启动子，为后续代谢途径关键基因的表达调控提供了稳定、可控的标准化元件。具体的代谢途径改造包括：1）敲除部分β-氧化循环途径和阻断脂肪酸从头合成途径，实现从不同脂肪酸底物到对应MCL/LCL PHA单体的碳原子守恒的生物转化；2）引入外源的短链PHA单体3HB（3-羟基丁酸）的合成途径（phaA-phaB）；3）引入低特异性PHA聚合酶编码基因（phaC_61-3）；4）对不同来源的基因及其表达模块的代谢通量进行组合优化。最终，当以葡萄糖作为单一碳源时，PHA中3HB含量提高约55%（图2）。

图2. 基因表达模块的代谢通量调谐优化

选用不同的3HB合成基因phaA和phaB并进行不同组合, 在聚合酶PhaC作用下，在嗜虫假单胞菌里实现了不同含量的聚-3-羟基丁酸（PHB）的合成，PHB的合成影响了细胞生长（表现为Cell Dry Weight，简称CDW）。3HB组成在PHA比例越大，材料硬度越高，细胞干重CDW也越大。而C9-C18的3HA单体给PHA共聚物提供了强度和韧性。

利用优化后的嗜虫假单胞菌工程底盘，团队分别以葡萄糖与不同碳原子数的脂肪酸作为混合碳源，首次成功合成了一系列可以定制化的新型SCL-co-MCL/LCL PHA共聚物（其中SCL PHA单体为3HB，MCL/LCL单体为碳原子数9-18的3-羟基脂肪酸，即MCL/LCL 3HA）（图3），并完成热力学性能表征，而且产量相较以往研究提升显著，PHA共聚物含量超过60 wt%。经技术经济分析（TEA）测算，该平台可使得新型PHA共聚物的综合生产成本大幅度降低。该平台也被证实能实现含不饱和脂肪酸侧链的PHA共聚物的高效合成，为PHA的化学修饰改性，以及无限想象空间的修饰带来的结构多样性。

图3. 嗜虫假单胞菌工程菌合成SCL-co-MCL/LCL PHA共聚物的合成及气相色谱验证分析

以上成果发表在Advanced Materials上 (Adv. Mater. 2021, 2102766)，论文第一作者为清华大学博士生李梦怡，共同第一作者为清华大学博士生马悦原，通讯作者为清华大学陈国强教授，共同通讯作者为华南理工大学叶健文副教授。

论文链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202102766

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